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WB 磷酸化蛋白曝不出條帶的時(shí)候，會(huì)特別沮喪，特別希望有人指點(diǎn)一二。CST 技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)總結(jié)了多年經(jīng)驗(yàn)和技巧，為您送出 13 條做好磷酸化蛋白 WB 的建議。

確定樣本中磷酸化蛋白的表達(dá)量
① 對(duì)的樣本，② 正確的處理方法，③ 合適的陽(yáng)性對(duì)照是實(shí)驗(yàn)成功的步。
① 實(shí)驗(yàn)前需先查閱文獻(xiàn)或通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該樣本是否表達(dá)，若該樣本根本就不表達(dá)目的蛋白，那就不要浪費(fèi)感情了吧。
② 若正常情況下樣本的磷酸化水平過(guò)低或不表達(dá)，可通過(guò)物理或化學(xué)方法進(jìn)行一定的刺激和誘導(dǎo)，刺激條件各不相同。但這并不代表刺激越多越好，充分但不過(guò)分（如磷酸化 IRS1，僅需刺激 5 min，刺激過(guò)久會(huì)進(jìn)入負(fù)反饋機(jī)制進(jìn)而開始降解）的正確刺激會(huì)幫助得到*佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
③ 有合適的陽(yáng)性對(duì)照至關(guān)重要，在任何實(shí)驗(yàn)中，我們都應(yīng)考慮包含適當(dāng)?shù)年?yáng)性和陰性對(duì)照，可使您進(jìn)一步確定抗體檢測(cè)到的特異性信號(hào)。

總蛋白和內(nèi)參對(duì)照都要做
普通的內(nèi)參如 Actin、GAPDH 等和總蛋白抗體的對(duì)照都要做嗎？對(duì)，都要做！普通內(nèi)參可以作為體系的對(duì)照，保證上樣量一致從而排除體系本身的影響，對(duì)于結(jié)果分析比對(duì)十分重要。
同時(shí)，總蛋白抗體也必不可少，僅僅是檢測(cè)到磷酸化蛋白表達(dá)量的增加并不能說(shuō)明問(wèn)題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值增加了才能說(shuō)明磷酸化水平增加，這種表述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方法是*客觀的，也是必需的。

確保完全裂解并使用新鮮樣本
相對(duì)于僅用裂解緩沖液裂解，裂解液裂解 + 超聲處理可確保整個(gè)細(xì)胞充分裂解并剪切染色質(zhì) DNA。建議在 35%~40% 的功率輸出條件下超聲 3 次，每次 10 s。由于不同儀器不同性能，請(qǐng)根據(jù)生產(chǎn)商的建議進(jìn)行優(yōu)化。超聲處理時(shí)應(yīng)保持低溫、冰上操作。如果您沒(méi)有探頭超聲儀，用細(xì)的注射器針頭反復(fù)吹打也能起到類似的作用。在得到樣品后，請(qǐng)不要反復(fù)凍融，建議 -80℃ 冰箱分裝保存。

小心蛋白殺手
組織或細(xì)胞裂解時(shí)會(huì)釋放出大量?jī)?nèi)源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，導(dǎo)致不同于正常生理狀態(tài)的差異。因此，在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，對(duì)于維護(hù)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，非常重要。否則條帶很淺不說(shuō)，結(jié)果可信度還不能保證。

樣品低溫處理
除超聲時(shí)保持低溫，在做磷酸化蛋白的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都要保證低溫環(huán)境。磷酸化蛋白在室溫條件下很容易被蛋白磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制劑也很明顯。所以務(wù)必要保持低溫環(huán)境！

用 5% 脫脂牛奶的 TBST 室溫封閉 1 h
網(wǎng)絡(luò)上流傳的磷酸化抗體不適于用牛奶封閉的說(shuō)法是沒(méi)有科學(xué)依據(jù)的。這一誤區(qū)的出現(xiàn)可能是由于實(shí)驗(yàn)者使用了非實(shí)驗(yàn)級(jí)奶粉引起的（國(guó)內(nèi)許多奶粉含有磷酸酶等雜質(zhì)）。

CST 建議轉(zhuǎn)膜后迅速在 TBS 中洗滌膜幾秒，以便移除殘留的轉(zhuǎn)膜緩沖液，隨后使用 5% 脫脂牛奶（請(qǐng)使用實(shí)驗(yàn)級(jí)的 #9999）的 TBST 室溫封閉 1 h，這一封閉步驟有助于降低非特異性一抗結(jié)合并降低背景。
另外應(yīng)避免膜封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)檫@會(huì)掩蓋抗原表位，阻止抗體結(jié)合。封閉后在 TBST 中洗滌 5 分鐘。CST 建議所有抗體均應(yīng)如此。CST 科學(xué)家生產(chǎn)驗(yàn)證每一支上市的抗體的每一種應(yīng)用，顯然更懂得如何讓抗體表現(xiàn)出*佳的狀態(tài)。

一抗稀釋液
請(qǐng)務(wù)必根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書中推薦的稀釋液稀釋一抗，不同產(chǎn)品有不同*佳稀釋液，采用 CST 推薦的一抗稀釋液并按標(biāo)準(zhǔn) protocol 操作實(shí)驗(yàn)，是您實(shí)驗(yàn)成功的保證。

4℃ 過(guò)夜孵育一抗
抗原抗體之間是一種非共價(jià)的結(jié)合，蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附抗體，這種物理吸附在高溫下會(huì)變?nèi)�，容易脫落，因此，首先保證 4℃ 的孵育條件非常重要。

其次要保證抗原和抗體相互磨合孵育的時(shí)間，磷酸化蛋白只占總量的極少部分，過(guò)夜可保證充分結(jié)合進(jìn)而曝出更漂亮的條帶。哪怕不是磷酸化蛋白，CST 也推薦 4℃ 過(guò)夜孵育，讓結(jié)果呈現(xiàn)的一面。

洗膜條件
一抗和二抗均建議用 1*TBST（相對(duì)于 PBST 緩沖液，*終信號(hào)會(huì)更強(qiáng)）洗膜 3 次，每次 5 min。洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致信號(hào)減弱（抗體從結(jié)合的位點(diǎn)脫落），過(guò)短則會(huì)導(dǎo)致背景深。
另外，洗膜的時(shí)候，盒子要比膜稍微大一圈，保證膜充分的在洗滌液中晃動(dòng)，且建議單張洗膜而非幾張一起清洗。

二抗室溫 1 h 孵育
用 5% 牛奶的 1*TBST 稀釋的二抗（BSA 稀釋二抗會(huì)產(chǎn)生較高背景），室溫 1 h 孵育即可。

掌控好曝光或壓片時(shí)間
磷酸化蛋白檢測(cè)除了容易有雜帶外，還容易出現(xiàn)高背景。所以曝光或壓片的時(shí)候注意掌控好時(shí)間，時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)使得背景深，過(guò)短又會(huì)不容易曝出條帶或曝出條帶很淺，所以需要優(yōu)化出適合自己靶蛋白和實(shí)驗(yàn)體系的*佳曝光時(shí)間。

磷酸化和總蛋白抗體到底怎么孵育？
一般磷酸化和總蛋白的條帶位置基本是一樣的，所以如果樣品比較珍貴或有限的情況下，可以在壓完磷酸化抗體后，將膜 strip 后再壓總蛋白抗體，stripping 的時(shí)候注意溫度盡量控制在 50℃ 以內(nèi)。不過(guò) CST 的做法是建議在樣品充足的情況下同時(shí)跑兩塊膠，比 strip 得到的結(jié)果更可信。對(duì)于有條件的實(shí)驗(yàn)室，可考慮做總蛋白和磷酸化蛋白的 In-Cell Western。

蛋白 Marker 很重要
做磷酸化蛋白 WB 時(shí)，除了目的蛋白的條帶外，還可能會(huì)出現(xiàn)一些非特異性條帶。所以在此情況下，請(qǐng)一定要根據(jù) marker 大小進(jìn)行比對(duì)，查看條帶的分子量。否則有可能會(huì)誤以為一些非特異條帶是自己想要的，分析半天走了冤枉路不說(shuō)，還耗費(fèi)了大量精力。