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想要研究蛋白質(zhì)，先要得到高度純化且具有生物活性的目的物質(zhì)，因此，蛋白樣品的制備是重要提。蛋白提取的質(zhì)量和效果對后續(xù)的研究分析有重要影響。不同種類的樣本在制備過程中，存在一些差異，要根據(jù)樣本特征調(diào)整實驗方案和操作細(xì)節(jié)。

基本原則
樣品處理盡量簡單，減少蛋白損失；
盡量避免蛋白的降解；
盡可能提高樣品蛋白的溶解度；
防止溶液介質(zhì)中對蛋白質(zhì)的人為修飾；
去除非蛋白雜質(zhì)。

制備過程
蛋白質(zhì)的制備一般要經(jīng)過以下四個階段：選擇材料和預(yù)處理，材料的破碎，提取和純化，濃縮、干燥和保存。由于蛋白種類繁多，性質(zhì)差異較大，因此不可能有一個固定的程序適用各類蛋白質(zhì)的分離。根據(jù)性質(zhì)進(jìn)行分類，大部分蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質(zhì)。

制備原理
蛋白質(zhì)在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非性疏水基團(tuán)與性親水基團(tuán)的比例，其次取決于這些基團(tuán)的排列和偶矩。故分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)是不同蛋白質(zhì)溶解差異的內(nèi)因。溫度、 pH、離子強(qiáng)度等是影響蛋白質(zhì)溶解度的外界條件。①溫度：多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。②pH：蛋白質(zhì)，酶是具有等電點的兩性電解質(zhì)，提取液的 pH值應(yīng)選擇在偏離等電點兩側(cè)的 pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。③離子強(qiáng)度：稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量 NaCl 等中性鹽，一般以 0.15 摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用 0.02-0.05M 磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。提取蛋白質(zhì)時常根據(jù)這些內(nèi)外因素綜合加以利用，將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取出來，并與其它不需要的物質(zhì)分開。

制備方法
破碎的方法有許多種，可歸納為：機(jī)械法（超聲波法、機(jī)械勻漿法、液氮研磨法和玻璃珠破碎法），化學(xué)法（去污劑法、酶裂解法、），物理法（循環(huán)凍融法、滲透法、高壓法）。這些方法有不同的應(yīng)用范圍，基本的原則都是要以小的限度減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解變性，這也就是在樣品制備破碎這一步的關(guān)鍵所在。而常用的方法有：超聲波法、機(jī)械勻漿法、液氮研磨法、鹽析、沉淀法。其中，有機(jī)溶劑沉淀法使用較為普遍，常用的有機(jī)溶劑有丙酮、苯酚等。

冷丙酮沉淀丙酮和苯酚沉淀法注意事項：
1.冷丙酮沉淀的時間與溫度。
常溫或升溫時，蛋白立體結(jié)構(gòu)展開，丙酮容易與其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸進(jìn)行疏水結(jié)舍導(dǎo)致蛋白變性，所以我們通常預(yù)冷丙酮并且低溫操作。
2.超聲功率和時間，重在觀察超聲后樣品溶性的均勻度。
3.一般和三氯乙酸一起使用，效果更好。
4.還原烷基化。

苯酚提取
1.各種試劑的正確及精確配制。（如：煎糖提取液）
2.加入飽和酚后要充分震蕩和離心。（使蛋白充分與酚、色素H鍵結(jié)合，讓其分三層）
3.需純化蛋白。（甲醇、TCA/冷丙酮去色素、苯酚等雜質(zhì)）

注意事項
1.在蛋白質(zhì)制備過程中使組織始終置于冰上，離心機(jī)、離心管等儀器設(shè)備要提預(yù)冷，以防蛋白質(zhì)的降解。
2. 要加入適量的裂解液，裂解一定要充分，均勻。
3. 植物和動物組織樣本一般采用研磨或勻漿機(jī)破碎處理，細(xì)胞和菌體樣本一般采用超聲破碎，破碎過程中要避免材料的融化。
4. 對預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實驗，應(yīng)冷凍保存（－80℃），對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。
5. 對于樣本量需求少的研究，且組織樣品本身非常細(xì)小，可直接裂解，減少蛋白損失。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司