檢測限和定量限是分析方法的重要屬性，在中國藥典2020年版分析方法驗證指導原則中規(guī)定這2項是重要的驗證指標，包括定量、限度的雜質測定需要著重考慮檢測限和定量限，且在該版本指導原則中刪除了校正因子以及其中定量限的規(guī)定。本文試圖從定義、測量方法、常見問題和解決方案進行簡單的討論，為分析方法驗證活動中檢測限和定量限的的開展提供定的參考。
1、檢測限和定量限的定義
檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的低量，定量限系指試樣中被測物能被定量測定的低量。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。而對微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質和降解產物時，應確定方法的定量限，需要注意的是定量限的測定結果應符合準確度和精-密度要求。
2、檢測限和定量限的測量方法
檢測限和定量限常用的測量方法有直觀法、信噪比法、基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法等3種方法，不同方法應用范圍有所不同：
（1）直觀法主要用于非
儀器方法，通過目視法觀察逐稀釋進樣獲得非儀器方法檢出限（或定量測定）的低濃度或量。
（2）信噪比法適用于能顯示基線噪音的儀器分析方法，是通過已知低濃度的被測物的檢測信號與基線噪音比較，確定可被檢測出的小量或濃度。檢測限般以信噪比為3:1或2:1；定量限般以信噪比為10:1。
（3）基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法可采用已知標準物質與空白樣品，或已知含量的樣品在低濃度范圍按照分析步驟進行測量，通過分析相當數(shù)量的樣品（需要12~20份）計算方法的檢出限和定量測定低濃度或量，其計算公式為（公式1）：
LOD（LOQ）=3.3（或10）δ/S
式中：LOD（LOQ）：檢測限（定量限）；δ：響應值的偏差；S：標準曲線的斜率。δ可以通過下列方法測得：（1）測定空白值的標準偏差；（2）標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差來代替。
3、檢測限和定量限的常見問題
由于使用上的方便性，信噪比法是目方法驗證中常用的測量方法。但信噪比受檢測儀器狀態(tài)的影響很大，且與耗材、試劑、樣品處理等多種因素相關，按信噪比3/10計算與驗證過的檢測限/定量限在下次檢測時并不是方法的檢測限/定量限，因此導致方法驗證出現(xiàn)異常，測量的定量限（檢測限）并不是真正的方法定量限，特別是定量限可能不能滿足精密度和準確度要求，即定量限測不準原理。
信噪比法測量檢測限和定量限的主要問題在于其本質上也是種直觀測量的方法，主要用于儀器檢出限的測量和判斷。而儀器檢出限（對于復雜的系統(tǒng)更應該稱為系統(tǒng)檢出限）則受到由整個檢測系統(tǒng)性能的影響（如高效液相法由HPLC儀器、色譜柱、流動相、檢測器共同組成），其是個動態(tài)的結果。當臺經確認的儀器（完成安裝確認IQ、設計確認DQ、運行確認OQ）在分析實驗室運行后，其性能必須經過定期的性能確認PQ，或者按計量規(guī)程進行校準，確定其整機性能如儀器檢出限等符合性能標準。如在JJG 705-2014
液相色譜儀檢定規(guī)程中，其小檢測濃度即儀器檢出限的方法即信噪比法，通過進樣低濃度的標準溶液，再根據(jù)標準溶液峰高和基線噪音峰高的比值計算，具體計算公式與公式2是致的。
由此可知，信噪比法反映出的是方法驗證當時狀態(tài)下系統(tǒng)檢出限/定量限，而非對于方法的檢測限/定量限，在實際使用不能盲從于信噪比3/10的結果。如作者以在進行個工藝相關雜質檢測HPLC分析方法驗證時，根據(jù)信噪比法計算的檢測限位1μg/ml、定量限為3μg/ml（驗證中S/N均大于10、均值在15左右），因此制定方法的標曲下限為5μg/ml，但在色譜柱使用幾個批次之后，發(fā)現(xiàn)標曲下限5μg/ml的S/N就已經掉到10以下了，此時原檢測限的S/N肯定也有著很大的變化，完全沒有達到方法驗證中檢測限、定量限驗證的目的。
4、檢測限和定量限的解決方案
因為檢測限和定量限常用測量方法的局限性，因此我們并不需要限定信噪比=3或10，而只需要驗證方法的靈敏度符合要求。如通常檢測限應低于限度的1/30，定量限應低于限度的1/10，但當達不到該要求時，只要規(guī)定定量限比ICH規(guī)定的雜質報告限低即可（如50%報告限）。
在檢測限的驗證中，可以通過加標的方法進行信噪比的確認，并可參考USP對于可檢測性的定義和確認步驟：
-1：配置個在限度濃度的雜質標準品溶液；
-2：配置個添加了限度濃度的雜質標準品的樣品標準品溶液；
-3：配置個添加了（限度濃度100%-由Horwitz方程估算%RSD）的雜質標準品的樣品標準品溶液；
如果1≤2且3＜2，則差異可以被檢出；否則該方法不能勝任限度檢測。
定量限可考慮設置個低于限度數(shù)倍的低濃度樣品（如5倍），在響應差的儀器中信噪比仍然遠大于10（如100），其回收率驗證與精密度驗證均符合規(guī)定，則可以認為該數(shù)字可以適用于后的日常檢測，如果檢測結果小于該值，則直接報告“小于該值”即可。如在采用熒光染色法測定外源性DNA殘留量中，ChP規(guī)定DNA殘留量在1.25～80ng/ml范圍內，本法線性較好，因此供試品DNA殘留量在該范圍內可定量測定；當DNA殘留量低于1.25ng/ml時應為限量測定，表示為小于1.25ng/ml。
設計合理的定量下限對于方法的靈敏度有著很好的保證，在實際操作中只需要驗證定量下限的準確度和精密度符合要求即可。如在復雜基質樣品中，通常以標曲下限作為定量下限，且定量下限的準確度和精密度要求可適當放寬，要求校正標樣回算的濃度般應該在標示值的±15%以內，定量下限處應該在±20%內，質控樣品準確度均值般應在質控樣品標示值的±15%之內，定量下限準確度應在標示值的±20%范圍內。
信噪比作為容易獲得的參數(shù)，在檢測限和定量限的測定中使用非常方便。主要需要考慮的是由于受儀器、色譜柱、試劑、泵系統(tǒng)、檢測器等的影響很大，方法的靈敏度存在著很大的風險。因此，可以分析方法標準操作規(guī)程SOP中規(guī)定靈敏度溶液的信噪比作為檢測有效的系統(tǒng)適用性標準，參見參考文獻[3]提供的范例：以有關物質為例，如某組分的限度0.1%，方法驗證時0.05%水平下信噪比20，回收率驗證與精密度驗證均符合規(guī)定，該水平為日常檢測報告的低值，則在系統(tǒng)適用性試驗中應確認該組分0.05%水平下信噪比不小于20。
5、小結
按照檢測限和定量限的常用測量方法如信噪比法的結果并不準確，其僅能反映在當條件下的儀器（系統(tǒng)）檢出/定量限。因此在分析方法驗證中，不能簡單地以信噪比3/10進行判定和驗證測限和定量限，而應該根據(jù)標準限度和相關法律法規(guī)，綜合考慮分析方法的靈敏度要求，并可以在分析方法標準操作規(guī)程SOP中規(guī)定靈敏度溶液的信噪比作為檢測有效的系統(tǒng)適用性標準。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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