在臨床免疫學(xué)檢測中，常以系列濃度
標準品測得劑量反應(yīng)曲線（即標準曲線），并以此推算待測未知標本的濃度。由于不同的擬合曲線存在不同程度的實測值與理論值的偏差，因此各種檢測項目的標準曲線需要選擇適當?shù)臄M合模式，通過選擇不同的函數(shù)關(guān)系式來改善標準曲線繪制的精密度，從而以較少的數(shù)據(jù)和計算獲得較為準確的結(jié)果。其常用的函數(shù)有插值法和曲線擬合，兩者都是依據(jù)已知的離散數(shù)據(jù)來尋找合適的函數(shù)表達式。區(qū)別在于，插值得到的函數(shù)能夠穿過已知的點，擬合只求函數(shù)圖形神似而不求穿過已知點。下面對兩種函數(shù)模式及分類進行簡要的介紹。
1. 插值法（interpolation method）
插值法的前提為假定已知數(shù)據(jù)是準確的，要求以某種方法描述數(shù)據(jù)點之間所發(fā)生的情況，所以插值是找到一個（或幾個分段光滑的）連續(xù)片段來穿過這些點。插值法需完全擬合試驗數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)點的精密度和準確性依賴大[1]。插值法又可分為線性插值法和樣條插值法。
1.1 線性插值是指將臨近的校準點以點對點的方式用一條直線連接起來。如圖一中的黃色線段。當數(shù)據(jù)點個數(shù)增加和它們之間距離減小時，線性插值就更精確。
1.2 樣條插值法是指將臨近的兩個校準點以一條曲線連起來，對整個標準曲線上各點間的短片段進行數(shù)學(xué)計算得到一條曲線。換句話說，就是將全部數(shù)據(jù)分割成若干部分，每個小部分用插值得到不同的函數(shù)，*后用很多不同的函數(shù)表達原來的序列，所獲得的合成數(shù)學(xué)函數(shù)稱為樣條函數(shù)。如圖一中的藍色曲線。
樣條插值法中*常用的方法是三次樣條插值，即將原始長序列分割成若干段構(gòu)造多個三次函數(shù)（每段一個），使得分段的銜接處具有二階導(dǎo)數(shù)連續(xù)的性質(zhì)，也就是各點的光滑銜接。當已知測定數(shù)據(jù)點較多時，其擬合的效果也和實際結(jié)果非常吻合。現(xiàn)在有些自動化的分析
儀器中，比如某些型號的全自動化學(xué)發(fā)光分析儀，計算結(jié)果就是使用三次樣條插值進行處理的。
2. 曲線擬合（curve fitting）
在實際工作中，變量間未必都有線性關(guān)系，例如免疫學(xué)標準曲線一般均為非線性的，這時就需要選擇適當?shù)那�類型來擬合已知的觀測數(shù)據(jù)，并用擬合的曲線方程分析兩變量間的關(guān)系。曲線擬合就是將離散的測量數(shù)據(jù)連續(xù)化，找到一個解析表達式的連續(xù)曲線來限度地逼近這些點。并不要求擬合曲線通過所有數(shù)據(jù)點，而是要求它反映對象整體的變化趨勢。常見的擬合模式有指數(shù)曲線擬合、對數(shù)曲線擬合、雙曲線模式、多項式模式、Log-Logit轉(zhuǎn)換、Logistic公式（兩參數(shù)、四參數(shù)）等，其中幾種常見模式的說明如下：
2.1 雙曲線擬合
雙曲線擬合是將測定反應(yīng)信號對標準品濃度的倒數(shù)作圖（ y = a + b(1/x) ），這種方法對于競爭性免疫測定的數(shù)據(jù)能擬合出很好的平滑曲線。但在標 準曲線的端值，特別是低濃度端，得不到好的擬合。
2.2 多項式模式
多項式擬合是指將測定反應(yīng)信號對標準品濃度作圖。三次多項式（y = a + bx + cx2 + dx3）常被用于競爭免疫測定數(shù)據(jù)的擬合，其形狀像倒狀的‘S’形。當試驗結(jié)果剛好在曲線的升段或者降段時擬合效果良好，但是對于區(qū)間較廣的情形, 由于其彎曲的波動，三次方程擬合模式不一定很好，且對于一個給定反應(yīng)值可能會對應(yīng)兩個結(jié)果，因此需要對校正曲線進行截尾。
2.3 Log-Logit轉(zhuǎn)換
Log-Logit轉(zhuǎn)換曲線擬合是指將logit（B/B0）對標準品濃度的對數(shù)作圖，經(jīng)過轉(zhuǎn)換后，進行*小平方回歸可得到良好的直線。這個模型一般適用于競爭法的擬合，所以擬合時要求至少有一個零濃度測試的OD值，并且此值為整個反應(yīng)的值（也就是我們常說的至少要做一個空白對照）。
2.4 Logistic公式（四參數(shù)）
Logistic公式擬合是指將測定反應(yīng)信號對標準品濃度的對數(shù)作圖。所謂四參數(shù)擬合，是指用含有四個參數(shù)的方程表示因變量y（如吸光度值）隨自變量x（如濃度值）變化的規(guī)律，公式為y = (a - d) / [1 + (x/c)b] +d，其中a為反應(yīng)值，b為斜率，c為拐點濃度，d為本底，R2為曲線擬合度，用來評價曲線擬合效果。結(jié)果輸出時要求求出a,b, c, d四個參數(shù)使曲線*優(yōu)，即R2≥0.99。曲線的形狀根據(jù)實際情況, 可能是一個單調(diào)上升的類似指數(shù)、對數(shù)或雙曲線的曲線, 也可能是一個單調(diào)下降的上述曲線, 還可以是一條S形曲線。四參數(shù)擬合回歸不僅限于競爭法, 實際上夾心法也可使用。在很多情況下它都可以擬合ELISA的反應(yīng)曲線, 所以它也成了ELISA中應(yīng)用*廣的模型。
在實際應(yīng)用中選擇擬合函數(shù)時，除了按照競爭免疫測定和非競爭免疫測定等粗略篩選外，還可以先根據(jù)數(shù)據(jù)做出散點圖，然后按照散點圖的走勢，直觀判斷確定擬合函數(shù)；也可以通過軟件（如CurveExpert，GraphPad等），自動做出所有擬合函數(shù)下的標準曲線，再根據(jù)R2值進行選擇。在化學(xué)發(fā)光免疫分析中，以各擬合模式反求標準品濃度，與其真值比較即可判斷擬合模式是否合理。例如有實驗室研究結(jié)果表明，應(yīng)用四參數(shù)模式擬合甲狀腺素化學(xué)發(fā)光法測定的標準曲線其實測值與真值相差*小[5]，而以樣條函數(shù)擬合胰島素的標準曲線測得的濃度更接近真值[2]。因此免疫分析的標準曲線應(yīng)進行擬合模式的選擇，以便找出與標準品真值*接近的模式，獲得*可靠的測定結(jié)果
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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