遠(yuǎn)慕生物分享－－-測培養(yǎng)細(xì)胞中污染的支原體
PCR法
原理該法是通過PCR技術(shù)將支原體16srRNA基因特異性擴增，來檢測培養(yǎng)細(xì)胞中污染的支原體。PCR引物選自16srRNA基因上的支原體特異片段，此片段與其他細(xì)菌的序列無交叉性雜交反應(yīng)。擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴乙啶（EB）染色后在紫外透射儀上進(jìn)行檢測。
u16srDNA引物用水稀釋至40umol/L。
（1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
（2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’
2）PCR擴增
（1）在冰浴中對各樣品制備PCR重要混合物，對每個樣品均加入：
10XPCR緩沖液5.0ml
25mmol/LdNTPs混合物0.4ul
40umol/L16srDNA引物每種引物1.0ul
40umol/LpBR322DNA引物每種2.0ul
pBR322DNA1pg/ml2.0ul
DNA聚合酶（5U/ml）0.2ul
三蒸水35.4ul
總量45ul
（2）用無菌去離子水稀釋樣品為1:10，1:100。
（3）于每個eppendorf管中加45ulPCR擴增混合物，每管中分別加入樣品原液及1:10，1:100稀釋液各5ul，操作均在冰浴中進(jìn)行。
（4）在每個eppendorf管中輕輕加入50ul無菌礦物油，覆蓋在液面上。如DNA擴增儀帶有有制式熱蓋，此步驟可省略。
（5）將各管放入DNA擴增儀的孔槽內(nèi)，并執(zhí)行以下循環(huán)指令：
①950C10min一個循環(huán)
②950C，30S→580C1min→720C1min,共30個循環(huán)。
③*后720C10min延長循環(huán)。
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