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流式
抗體的選擇：
1.流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇*基本的條件：目標(biāo)
蛋白特異性，反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實驗。
2.流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在流式實驗過程中，盡量減少實驗工序和過程，以保證實驗的真實和準(zhǔn)確性。因此在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實驗而不去做間接標(biāo)記。
3.流式抗體熒光標(biāo)記的選擇：如果實驗中檢測單一指標(biāo)：不同熒光標(biāo)記在不同的
儀器上強(qiáng)度不同。FACSCalibur儀器為例：PE＞APC＞PE-Cy5＞PerCP＞FITC＞PerCP-Cy5.5，通常來說，PE*強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原。FITC強(qiáng)度較弱，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原，使用范圍比較廣。用戶需根據(jù)檢測的目標(biāo)蛋白進(jìn)行具體選擇。如果同時檢測多個指標(biāo)：確認(rèn)流式
細(xì)胞儀能檢測多少個通道：流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。如：實驗者同時檢測三個指標(biāo)，可以在圖1中綠色、黃色和紅色三個通道中各選一個適當(dāng)?shù)臒晒馑貥?biāo)記，F(xiàn)ITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標(biāo)選擇同一個通道的熒光標(biāo)記，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響*后結(jié)果。因此，流式細(xì)胞儀的通道越多，同一份樣本能同時做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多。常用熒光標(biāo)記包括FITC,PE,PEcy5,PEcy5.5,APC等。
同型對照的選擇：
流式細(xì)胞實驗和其他抗體相關(guān)實驗有點(diǎn)不同的就是需要選擇同型對照。同型對照，是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，相當(dāng)于實驗的陰性對照。同型對照選擇與標(biāo)記抗體同種屬來源，同亞型，同熒光標(biāo)記的抗體。比如：抗人的CD3的PE標(biāo)記的抗體，小鼠的IgG2a。同型對照選擇PE標(biāo)記的小鼠的IgG2a。
流式抗體的選擇使用注意事項：
1建議實驗細(xì)胞的數(shù)量和抗體的比例要適當(dāng)。細(xì)胞過量或抗體過量都可能使實驗結(jié)果受影響，因此需要優(yōu)化試驗條件。注：不同的流式技術(shù)對抗體的需求量有較大差異，例如傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)（采用鞘液流系統(tǒng)）需要1×106個細(xì)胞為起始上樣量，抗體用量為10μl，而微流式細(xì)胞術(shù)則只需5×105個細(xì)胞，抗體用量減少到5μl。
2直標(biāo)的流式抗體應(yīng)該4℃避光保存，不要冷凍。
3盡量選擇經(jīng)實驗驗證的流式抗體，以保證實驗結(jié)果。默克密理博公司Milli-Mark系列流式抗體已經(jīng)通過了實驗驗證，并且提供了相關(guān)數(shù)據(jù)圖供用戶參考。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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