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　　膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，作用對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。消化原代培養(yǎng)的上皮類細(xì)胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（簡(jiǎn)稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟制品,對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用,主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開(kāi),在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同,對(duì)細(xì)胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用,取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無(wú)機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長(zhǎng)短等.

膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶,對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用.適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用,對(duì)細(xì)胞本身影響不大,可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,即操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率,終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無(wú)需機(jī)械振蕩,但膠原酶價(jià)格較高,大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本.

酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為 0.1%-0.25%（活力 1:200 或 1:250），但遇到難消化的組織時(shí)，濃度可適當(dāng)提高，消化時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。

溫度 一般認(rèn)為胰蛋白酶在 56℃時(shí)活性強(qiáng)，但由于對(duì)細(xì)胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為 37℃，通常在 37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。

pH pH8~pH9 是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強(qiáng)分散快，細(xì)胞也容易被消化下來(lái)，消化分離細(xì)胞時(shí) PH 只能選用 7.6~8.0 之間，否則對(duì)細(xì)胞有損傷。

無(wú)機(jī)鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來(lái)配制胰蛋白酶時(shí)，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配制時(shí)應(yīng)采用無(wú)鈣鎂離子的 PBS 配制。

消化時(shí)間 如果細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可以損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞的代謝，一般消化時(shí)間為 20 分鐘為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液，于 4℃過(guò)夜也可。

分離方法如下：

①過(guò)夜冷消化 將取得的組織用 Hanks 液洗三次，剪成碎塊大小為 4 毫米左右，用 Hanks 液洗 2~3 次以除去血球和脂肪組織，再加入 0.25% 的胰蛋白酶，搖勻后放 4℃過(guò)夜，次日再用 Hanks 液洗滌，棄去上清，共洗 2~3 次，然后，加入少量營(yíng)養(yǎng)液吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。

②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：

熱消化多次提取 －－ 將剪碎的細(xì)胞塊加入 0.25% 胰蛋白酶 37℃水浴中消化 15~20 分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液，按合適的濃度分瓶培養(yǎng)，然后將留下的未徹底消化的組織按上述方法操作，再消化提取細(xì)胞。

冷消化多次提取 －－ 方法同上，只是消化溫度為 4℃。

先熱消化后冷消化 －－ 將組織塊先用胰蛋白酶于 37℃下消化 20 分鐘經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散，制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于 4℃下過(guò)夜，次日再提取細(xì)胞，分散成懸液，分瓶培養(yǎng)。

?膠原酶（Collagenase）消化法

膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對(duì)細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用 PBS 和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率，終濃度 200u/mL 或 0.1~0.3mg/mL. 此酶消化作用緩和，無(wú)需機(jī)械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。

經(jīng)過(guò)膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細(xì)胞對(duì)酶有耐受性，可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被完全消化開(kāi)。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)，因此不必要再進(jìn)一步消化處理。

非酶消化法（EDTA 消化法）

EDTA 是一種非酶消化物，又稱螯合劑或 Versene, 全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的 PBS 配成 0.02% 的工作液，對(duì)一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離，缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1 或 2:1），不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。

消化分離法的操作步驟：

（1）剪切 把組織塊剪碎，呈 1~5mm3?大小的組織塊。

（2） 加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無(wú)鈣鎂 PBS 洗 2-3 次（采用傾斜，自然沉降法）。

（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA）于 37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間（中間可輕搖 1~2 次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

（4）棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。

（5）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗 2-3 次后，加入完全培養(yǎng)基。

（6）機(jī)械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開(kāi)后用紗網(wǎng)或 3~4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降 5~10 分鐘，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)如下：

（1）組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。

（2）胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用。

（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法

原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng) 是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的步，是一項(xiàng)基本技術(shù)。原代細(xì)胞因剛從組織中分離開(kāi)，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來(lái)的遺傳特性，也接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。

原代細(xì)胞往往有多種細(xì)胞組成，比較混雜，即使從形態(tài)上為同一類型（上皮樣或成纖維樣），但細(xì)胞間仍有很大差異。如果供體不同，即使組織類型、部位相同，個(gè)體差異也照樣存在，原代細(xì)胞生物特性尚不穩(wěn)定，如需做較為嚴(yán)格的對(duì)比性實(shí)驗(yàn)研究，還需進(jìn)行短期傳代培養(yǎng)。

1、組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法：為將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng)，方法簡(jiǎn)便，利于培養(yǎng)，部分種類的組織細(xì)胞在小塊貼壁 24 小時(shí)后細(xì)胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長(zhǎng)成肉眼可以觀察到的生長(zhǎng)暈，5~7 天后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周圍延伸的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實(shí)驗(yàn)研究。

其培養(yǎng)方法如下：

（1）按照述方法取材，將組織剪成或切成 1mm3?大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤(rùn)。

（2）將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距 0.2 cm~0.5cm，一般在 25mL 培養(yǎng)瓶（底面積為 17.5cm2）可接種 20~30 小塊為宜，小塊放置后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底朝上，然后于瓶?jī)?nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞，將瓶?jī)A斜放置在 37℃溫箱內(nèi)。

（3）培養(yǎng) 2~4 小時(shí)，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動(dòng)作要輕，嚴(yán)禁搖動(dòng)和來(lái)回振蕩，以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤(rùn)即可，培養(yǎng) 24 小時(shí)后再補(bǔ)液，培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放，開(kāi)始幾天盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長(zhǎng)，培養(yǎng) 3~5 天時(shí)可換液，一方面補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。

原代細(xì)胞培養(yǎng) -2

2、消化培養(yǎng)法

該方法是采用述的消化分散法，將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液，然后分瓶培養(yǎng)。

某些特殊類型細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞等的消化手段和步驟，將在有關(guān)章節(jié)中敘述。

3、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法

對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。

4、器官培養(yǎng)

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，其特性仍保持原有器官細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和聯(lián)系、并能存活，器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細(xì)胞培養(yǎng)不同，但可利用器官培養(yǎng)對(duì)器官組織的生長(zhǎng)變化進(jìn)行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對(duì)器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。體外器官培養(yǎng)為臨床上的器官移植創(chuàng)造了便利的條件。器官培養(yǎng)的條件與細(xì)胞培養(yǎng)不同，要有特殊的要求。

1、器官培養(yǎng)的特殊的要求

（1）需要特殊的培養(yǎng)條件 因器官離體培養(yǎng)，其營(yíng)養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來(lái)供給，因此，培養(yǎng)時(shí)為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營(yíng)養(yǎng)而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過(guò) 1mm.

（2）器官內(nèi)部細(xì)胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法：

a. 將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換。

b. 提高培養(yǎng)基中的氧分壓，一般需加注純氧，提高氧分壓時(shí)仍需保持 5% CO2, 以維持 pH.

2、器官培養(yǎng)的方法

（1）將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養(yǎng)皿中，高度為 1/2 皿高，使其表面鋪上 0.5mm 孔徑的濾膜。

（2）將培養(yǎng)基加入平皿中，使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜，但不要使濾膜浮起。

（3）將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上，一般厚度不要超過(guò) 200μm, 水平面積不超過(guò) 10mm2, 如為肝、腎不能大于 1mm2.

（4）將培養(yǎng)物置于 CO2?培養(yǎng)箱內(nèi)，并加注氧氣，調(diào)整氧分壓達(dá) 90%, 培養(yǎng)時(shí)注意使液面與膜保持在一致的水平上。

（5）上述器官培養(yǎng) 1~3 周（每隔 2~3 天換液一次）后可用于實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。