核酸檢測(cè)流程你知道嗎
閱讀次數(shù)：451 發(fā)布時(shí)間：2022/3/3 11:22:05
HIV核酸定性檢測(cè)技術(shù)，其檢測(cè)過(guò)程分為核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、擴(kuò)增產(chǎn)物定性分和結(jié)果判定和完成報(bào)告單。
實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)具體步驟如下：
1. 核酸提取
使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動(dòng)化儀器等商品化試劑或設(shè)備并按說(shuō)明書(shū)操作。提取RNA時(shí)應(yīng)注意防止RNA降解。DNA應(yīng)置于-20℃保存，RNA和需長(zhǎng)期保存的DNA應(yīng)置于-80℃保存。
2. 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無(wú)RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴(kuò)增儀或水浴箱中，在規(guī)定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進(jìn)行輪擴(kuò)增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無(wú)RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴(kuò)增儀或水浴箱中，在規(guī)定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用商品化RT-PCR一步法試劑進(jìn)行輪擴(kuò)增反應(yīng)。
3. PCR擴(kuò)增反應(yīng)（使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法）
PCR反應(yīng)需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和適量無(wú)RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）。在擴(kuò)增儀中，按照設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增。使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法。
4. 擴(kuò)增產(chǎn)物定性分析
擴(kuò)增產(chǎn)物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較，判斷擴(kuò)增片段是否在預(yù)期的分子量范圍內(nèi)。其它擴(kuò)增產(chǎn)物分析方法還有限制性內(nèi)切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。自動(dòng)化核酸擴(kuò)增儀使用酶聯(lián)比色分析或熒光探針雜交等原理測(cè)定。
5.結(jié)果判定和完成報(bào)告單
（1）實(shí)驗(yàn)成立的條件：每一次檢測(cè)需同時(shí)做兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照、兩個(gè)陰性對(duì)照，只有陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出預(yù)期的片段、陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出任何片段、雙份平行樣品結(jié)果一致的情況下實(shí)驗(yàn)才成立，可以作出核酸陽(yáng)性或陰性反應(yīng)結(jié)果的判定。
（2）HIV核酸檢測(cè)陽(yáng)性：發(fā)現(xiàn)核酸陽(yáng)性反應(yīng)，應(yīng)該重復(fù)采集樣品進(jìn)行復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)結(jié)果呈核酸陽(yáng)性反應(yīng)則判定為核酸陽(yáng)性，復(fù)測(cè)結(jié)果為核酸陰性反應(yīng)則判為不確定結(jié)果，需進(jìn)一步隨訪檢測(cè)。
（3）HIV核酸檢測(cè)陰性：只可報(bào)告本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性。
（4）應(yīng)在完成檢測(cè)后5個(gè)工作日內(nèi)發(fā)出檢測(cè)報(bào)告。
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