一、如何搭配流式抗體熒光標(biāo)記流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個(gè)因素決定的：流式細(xì)胞儀能檢測(cè)多少個(gè)通道、需要同時(shí)檢測(cè)檢測(cè)多少個(gè)指標(biāo)、廠家的抗體有多少種熒光標(biāo)記。如果流式細(xì)胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時(shí)做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多
A、 如何根據(jù)流式細(xì)胞儀搭配流式抗體1） BD流式細(xì)胞儀
流式細(xì)胞儀能檢測(cè)多少個(gè)通道是由有多少根激光決定的以及每根激光的功能決定的，所以先需要注意兩點(diǎn)：
流式細(xì)胞儀有哪些激光。比如標(biāo)配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三個(gè)熒光通道/三個(gè)顏色，而選配的Calibur (FACSCalibur的簡(jiǎn)稱(chēng))配有488nm和635nm兩根激光，可以檢測(cè)FL1-FL4四個(gè)通道/4個(gè)顏色。
不同型號(hào)的流式細(xì)胞儀的同樣的一個(gè)通道檢測(cè)熒光素的能力是不一樣的，比如Calibur的FL3（第3通道）能檢測(cè)PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能檢測(cè)PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能檢測(cè)的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測(cè)。Calibur和LSR都能檢測(cè)4個(gè)顏色，但是第4個(gè)通道檢測(cè)熒光素是不一樣的
搭配熒光素原則搭配流式熒光素有2個(gè)原則：每個(gè)通道只能選擇1種熒光素；各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配，但需注意
1、每個(gè)通道只能選擇1種熒光素。以Calibur為例說(shuō)明，Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC Calibur的FL3通道盡管能檢測(cè)PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個(gè)熒光素，但是我們我們搭配的時(shí)候只能選擇其中1個(gè)。
2、各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配：如果客戶的流式細(xì)胞儀能做4個(gè)通道，在第1個(gè)原則之下，那么每個(gè)通道隨便選出1個(gè)熒光素就可以組合成4個(gè)顏色。以2跟激光的Calibur為例，Calibur各個(gè)熒光素之間可以搭配出16種組合。
比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )＋P E（F L 2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 這個(gè)搭配組合可以更改成Alex Fluro(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+Alex Fluro(FL4)，或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PE-Cy5（FL3）+APC(FL4)等等。總之，在第1原則之下，我們可以隨意搭配和組合各個(gè)熒光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，上流式以后，容易導(dǎo)致補(bǔ)償過(guò)度
B、抗體有多少種熒光素1）供應(yīng)商能提供的每種抗體的熒光素是不一樣的我們需要根據(jù)同時(shí)結(jié)合供應(yīng)商能提供的每種抗體的熒光素進(jìn)行搭配。原則上同一個(gè)標(biāo)志的不同的克隆號(hào)帶同1個(gè)熒光素在應(yīng)用上沒(méi)有區(qū)別的，但是有些不同克隆號(hào)的抗體之間可能會(huì)有一些稍微的差異，需要仔細(xì)看說(shuō)明書(shū)。我們可以盡量選擇在說(shuō)明書(shū)上有流式圖形的抗體，或者選擇熒光素種類(lèi)多的克隆號(hào)的抗體
2） 熒光素
為什么要推薦使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢？
因?yàn)檫@些熒光非常明亮，對(duì)激光非常穩(wěn)定，適合流式細(xì)胞儀的光譜性質(zhì)，對(duì)PH值不敏感，具有水溶性。此外，他們聯(lián)合使用時(shí)發(fā)射光譜存在巨大差異，無(wú)需補(bǔ)償。
C、如果檢測(cè)的指標(biāo)數(shù)目超過(guò)了流式細(xì)胞儀的通道，怎么辦？
如果需要做5個(gè)指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀只能做4個(gè)通道，先將指標(biāo)歸成2類(lèi)，再將樣本分成2份，分別檢測(cè)。比如需要同時(shí)檢測(cè)CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。
二、同型對(duì)照（Isotypy Control）1、為什么要用同型對(duì)照？
同型對(duì)照是使用與一抗相同種屬來(lái)源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球
蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型對(duì)照是真正意思上的陰性對(duì)照，它不但可以用來(lái)設(shè)定流式細(xì)胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細(xì)胞因子競(jìng)爭(zhēng)封閉步驟。在流式細(xì)胞儀上樣，染色方式如下：
樣本管：一抗＋樣本
同型對(duì)照管：同型對(duì)照＋樣本
2、如何選擇同型對(duì)照？一般選擇與一抗的成分完全相同種屬來(lái)源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標(biāo)記的抗體，比如抗人的CD56 APC標(biāo)記的抗體,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對(duì)照應(yīng)該是APC標(biāo)記的Mouse IgG1,&kappa。注意同型對(duì)照的成份跟它的名稱(chēng)是相同的.如果是抗體的組合形式是純化的一抗＋熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇一抗的同型對(duì)照。比如CDw125的純化抗體，貨號(hào)是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型對(duì)照是純化的Mouse IgG1,κ。它的二抗PE標(biāo)記的抗小鼠IgG1。那么染色方式如下：
樣本管：純化的CDw25＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1＋樣本
同型對(duì)照管：純化的同型對(duì)照＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1＋樣本
如果沒(méi)有找到適合的同型對(duì)照，在保持來(lái)源相同、熒光標(biāo)記相同、免疫球蛋白類(lèi)別相同條件下，那么優(yōu)先選擇的順序應(yīng)該是亞鏈不同－－亞型不同－－相同類(lèi)別。比如，某種的抗體的來(lái)源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對(duì)照表里面找到不到完全相同的同型對(duì)照，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2а為同型對(duì)照。如果也沒(méi)有找到Mouse IgG2а，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2b作為同型對(duì)照。如果后還是沒(méi)有找到Mouse IgG2b，那么選者相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2作為同型對(duì)照。
3、如何查找同型對(duì)照？同型對(duì)照在BD英文目錄中或者BD網(wǎng)站上跟它對(duì)照的抗體的位置是一致的。BD目錄中，抗人的抗體的同型對(duì)照都在HUMAN章節(jié)后面。抗小鼠的抗體的同型對(duì)照在MOUSE章節(jié)后面，非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)的抗體同型對(duì)照在NON HUMAN PRIMATE章節(jié)后面。由于抗大鼠的抗體非常少，大部分抗體都是小鼠來(lái)源的，所以它的同型對(duì)照跟小鼠的一樣，放在MOUSE章節(jié)后面。胞內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子、補(bǔ)體、炎癥介質(zhì)及其受體的同型對(duì)照放在其章節(jié)的后面（注意：人的胞內(nèi)細(xì)胞因子的同型對(duì)照跟人的表面標(biāo)志的同型對(duì)照是不在一起的）。Phosflow的同型對(duì)照在Phosflow的介紹后面。比如，比如抗人的CD56 APC標(biāo)記的抗體，成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對(duì)照應(yīng)該是在HUMAN章節(jié)中Mouse，APC標(biāo)記的Mouse IgG1,&kappa。
4、哪些客戶需要使用同型對(duì)照？A 對(duì)流式不是非常熟悉的客戶。
B 做胞內(nèi)流式客戶，比如胞內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子和信號(hào)蛋白等。
C 使用不常見(jiàn)的標(biāo)志或者特異性不高的標(biāo)志的客戶，因?yàn)榭蛻舨皇煜げ怀Ｒ?jiàn)標(biāo)志的表達(dá)情況，根據(jù)同型對(duì)照可以判斷陽(yáng)性細(xì)胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié)合非常多，使用同型對(duì)照可排除假陽(yáng)性。
D 對(duì)流式非常熟悉又使用常用的表面標(biāo)志的客戶一般可以不使用同型對(duì)照。
5、為什么有時(shí)候同型對(duì)照的表達(dá)會(huì)比抗體的表達(dá)高？先需要檢查同型對(duì)照的抗體是否加錯(cuò)類(lèi)型、劑量等。其次，因?yàn)橛行?biāo)志在細(xì)胞的表面或者胞內(nèi)表達(dá)不高，而跟其類(lèi)似的抗原非常多，那么加入同型對(duì)照時(shí)，同型對(duì)照非特異性的結(jié)合會(huì)超過(guò)抗體的特異性，所以會(huì)造成這種現(xiàn)象，在細(xì)胞表面時(shí)如圖所示。這個(gè)時(shí)候推薦使用其他陰性對(duì)照，如空白對(duì)照等。
三、補(bǔ)償微球流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償隔一段時(shí)間之后需要調(diào)整到適合的位置。如果熒光補(bǔ)償沒(méi)有調(diào)節(jié)好，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分群不明顯或者流式檢測(cè)得到的結(jié)果圖非常不漂亮，而且會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果的不真實(shí)。熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)對(duì)初學(xué)者來(lái)說(shuō)非常不容易掌握，同時(shí)，補(bǔ)償調(diào)節(jié)是流式細(xì)胞術(shù)中比較難掌握的操作。尤其是一些不常見(jiàn)的標(biāo)志檢測(cè)時(shí)，需要經(jīng)驗(yàn)非常豐富的流式操作者根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)判斷調(diào)節(jié)補(bǔ)償，才可以得到比較好的數(shù)據(jù)和圖片。那么，現(xiàn)在不需要這么麻煩。因?yàn)檠a(bǔ)償微球讓一切變得更簡(jiǎn)單。BD CompBeads是用于流式細(xì)胞儀多色分析的熒光補(bǔ)償調(diào)整微球。它的實(shí)用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析時(shí)補(bǔ)償難調(diào)、耗費(fèi)樣本（往往用待測(cè)樣本單標(biāo)來(lái)進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)）的缺點(diǎn)。它本身不攜帶任何熒光，借助于與客戶自己的特異性熒光抗體孵育結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償。它不但能象待測(cè)的樣本細(xì)胞一樣在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下固定、破膜等，操作起來(lái)很簡(jiǎn)單，靈敏度高，一致性好，使補(bǔ)償更輕松更準(zhǔn)確，而且難得的是它適合于多色分析（如五色、六色、七色等）和復(fù)合熒光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因?yàn)檫@時(shí)的補(bǔ)償往往難度較大。各型號(hào)的流式儀器均能使用。Compbeads使用后可以將流式的條件保存，方便下次做同樣的熒光染色搭配時(shí)參考用。
客服一
