本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點，珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊
儀器配合應用，兩者均有詳細的使用說明，嚴格遵照規(guī)定操作，必能得出準確的結果。
1. 標本的采取和保存
可用于ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種
抗體或抗原成份。
可直接進行測定的標本：如血清、尿液。
需經(jīng)預處理的標本：如糞便和某些分泌物。
大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維
蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、血收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。
血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。
2. 試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
3. 加樣
在ELISA中般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
加標本般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。
4. 保溫
在ELISA中般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有定的溫度和時間，這保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當。
ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有貼近孔壁的層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要定時間的溫育。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。
客服一
